Описание
Иммуноферментный анализ фипронила (ELISA)
Руководство по эксплуатации комплекта
Этот набор предназначен только для исследовательских целей.
1 Цель использования:
Этот набор используется для количественного определения остатков фипронила в кормах, рыбе, креветках и мясных тканях (таких как курица, говядина и свинина), яйцах, меде, молоке, сыворотке и моче.
2 Принцип эксперимента
В этом наборе используется конкурентный метод ELISA. Микропланшет покрывают фипронил-связанным антигеном, добавляют стандарт или образец фипронила, свободный фипронил предварительно покрывают фипронил-связанным антигеном на микролунке. После добавления стоп-раствора используйте устройство для считывания микропланшетов, чтобы определить при длине волны 450 нм оптическую плотность и содержание фипронила в образце. Обратно пропорционально, содержание фипронила в образце рассчитывали по стандартной кривой.
3 Состав комплекта
3.1 Планшет для ELISA с отсоединяемым фипронилом антигеном с предварительно нанесенным покрытием: 1 шт. (12 лунок × 8 полосок).
3.2 Стандарт фипронила: 6 бутылок (1 мл / флакон), содержание: 0 частей на миллиард, 0,1 частей на миллиард, 0,3 частей на миллиард, 0,9 частей на миллиард, 2,7 частей на миллиард, 8,1 частей на миллиард.
3.3 Ферментный конъюгат анти-фипронил-антитело: 1 флакон (6 мл).
3.4 Проявитель цвета A: 1 флакон (6 мл).
3.5 Цветная проявляющая жидкость B: 1 флакон (6 мл).
3.6 Стоп-раствор: 1 флакон (6 мл), 2M серная кислота.
3.7 Разбавитель образца: 1 флакон (10 ×, 6 мл), используемый для разбавления образца.
3.8 Концентрированная промывочная жидкость: 1 флакон (20 × 20 мл), используемый для промывки планшетов.
3.9 Один лист с инструкциями.
4 Необходимые, но не предоставленные материалы
4.1 Оборудование
4.1.1 Считыватель микропланшетов с длиной волны 450 нм.
4.1.2 Дробилка.
4.1.3 Измерительный цилиндр.
4.1.4 Осциллятор.
4.1.5 Воронка.
4.1.6 Ватман № 1 или эквивалентная фильтровальная бумага. 4.1.7 Микропипетка.
4.2 Реагенты
4.2.1 Деионизированная вода или дистиллированная вода.
4.2.2 Метанол.
5 хранения
5.1 Набор хранится при 2 ~ 8 ℃, не замораживать
5.2 Неиспользованные микропланшеты следует запечатать и хранить в сухом виде.
6 вопросов, требующих внимания
6.1 Пожалуйста, внимательно прочтите инструкции перед использованием набора.
6.2 Не используйте наборы с истекшим сроком годности.
6.3 Перед использованием набора доведите реагенты до комнатной температуры (25 ± 2 ° C). Рекомендуется возвращать к температуре не менее 2 часов.
6.4 Стандартный продукт содержит фипронил, поэтому при его использовании следует соблюдать особую осторожность и носить перчатки во время работы.
6.5 Стоп-раствор содержит серную кислоту, которая предотвращает ожоги кожи и коррозию одежды во время использования.
6.6 Советы для разных стандартов и образцов нельзя смешивать, иначе это повлияет на результаты испытаний.
6.7 Нельзя смешивать реагенты в наборах с разными номерами партий; наконечники, используемые для разных стандартов и образцов, нельзя смешивать, иначе это повлияет на результаты эксперимента.
6.8 Разбавитель образца из этого набора должен использоваться при разбавлении образца, в противном случае это повлияет на результаты эксперимента.
6.9 При смешивании реагентов следует избегать вспенивания.
7 Приготовление рабочей жидкости
7.1 Стандартный раствор фипронила: 0ppb, 0,1ppb, 0,3 ppb, 0,9ppb, 2,7 ppb, 8,1ppb.
7.2 Концентрированная промывочная жидкость: разбавить 1:20 (1 + 19) дистиллированной водой для использования.
7.3 Разбавитель пробы: разбавить 1:10 (1 + 9) дистиллированной водой для использования.
7.3 Хромогенный агент: зарезервирован, избегать попадания прямого света
7.4 Раствор для остановки реакции: готов к использованию
8 Процедуры обработки образцов (образцы должны использоваться строго в соответствии с инструкциями во время процесса экстракции, а процесс экстракции должен быть точно разбавлен, иначе результаты будут неточными, образцы должны храниться в прохладном и темном месте и в холодильнике)
8.1 Взять 10 г измельченного образца и добавить 20 мл 70% раствора метанола.
8.2 Энергично вибрируйте в течение 3 минут.
8.3 Фильтр с фильтровальной бумагой Whatman No 1
8.4 Возьмите 25 мкл обработанного образца и добавьте 25 мкл разбавителя образца в реакционную лунку (коэффициент разбавления образца равен 2).
9 этапов иммуноферментного анализа
9.1 Экспериментальные инструкции
9.1.1 Пожалуйста, полностью восстановите все реагенты вне коробки до комнатной температуры (25 ± 2 ° C) перед началом эксперимента в течение примерно 2 часов. После нагревания до комнатной температуры (25 ± 2 ℃) выньте микропористые полоски, закройте лишние микропористые полоски и сразу же храните их при 2 ~ 8 ℃.
Примечание. Убедитесь, что возврат температуры достаточен, в противном случае это повлияет на точность определения.
9.1.2 Сразу после использования поместите реагент на хранение при 2 ~ 8 ℃.
9.1.3 Пожалуйста, не меняйте программу анализа
9.1.4 Используйте точную микропипетку.
9.1.5 После запуска операции не прерывайте никакую программу.
9.1.6 Воспроизводимость результатов ELISA во многом зависит от рабочих процедур, пожалуйста, действуйте строго в соответствии с требованиями.
9.1.7 Во избежание перекрестного загрязнения каждый стандарт и образец должны быть заполнены разными наконечниками.
9.1.8 Не позволяйте кончику пипетки касаться раствора или внутренней поверхности микролунки при добавлении образцов.
9.2 Этапы анализа
9.2.1 Предварительная нумерация, обозначение поз.
Для определения содержания B0, стандартов и образцов рекомендуется проводить обнаружение двойных отверстий.
9.2.2 Возьмите необходимое количество микропор (полоски с микропорами можно удалить), повторно запечатайте лишние полоски и немедленно поместите их обратно при 2 ~ 8 ℃ для хранения.
9.2.3 Раствор для разбавления образца (10х), концентрированный промывочный раствор (20х) разбавляют рабочим раствором (разбавленным дистиллированной или деионизированной водой).
9.2.4 Добавьте 50 мкл стандартного раствора 0,0ppb в лунку B0.
9.2.5 Добавьте 50 мкл стандартного раствора в каждую стандартную лунку.
9.2.6 Добавьте 50 мкл раствора образца в каждую лунку для образца.
9.2.7 Добавить 50 мкл ферментного конъюгата анти-фипронил-антитело во все лунки.
9.2.8 Осторожно встряхните реакционный планшет в течение нескольких секунд.
Теплая ванна 9,337 ℃ в течение 30 минут (время от времени постукивая по реакционной пластине во время теплой ванны, можно уменьшить ошибку двойного отверстия)
9.3.1 Стряхните жидкость в лунках, промойте микропланшет 5 раз лосьоном и постучите по абсорбирующей бумаге в последний раз, чтобы полностью удалить жидкость из лунок.
9.4 Реакция
9.4.1 После завершения процедуры промывки немедленно используйте микропипетку для добавления 50 мкл хромогенного раствора A, а затем 50 мкл хромогенного раствора B в каждую микролунку; слегка встряхните реакционную пластину, чтобы тщательно перемешать
9.4.237 ℃ теплая ванна в течение 10 минут
9.4.3 Добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и хорошо перемешайте.
9.4.4 Определяют оптическую плотность при 450 нм и считывают результат в течение 5 минут.
10 Расчет результата
10.1 Количественный анализ
10.1.1 Среднее значение (B) значения поглощения каждого стандартного раствора концентрации и полученного образца делится на значение поглощения (B0) первого стандарта (0 стандарта) и умножается на 100%, что представляет собой процентное значение поглощения. .
B – среднее значение абсорбции стандартного раствора или раствора образца. B0 – среднее значение абсорбции стандартного раствора 0ppb.
10.1.2 Используйте логарифмическое значение концентрации фипронила в качестве оси X и значение оптической плотности в процентах в качестве оси Y, чтобы построить стандартную кривую. В соответствии с процентным значением поглощения образца абсцисса соответствующей точки может быть получена из кривой, которая представляет собой логарифм концентрации фипронила, а антилогарифм представляет собой концентрацию фипронила C (частей на миллиард) в растворе для измерения.
10.1.3 Поскольку образец был предварительно разбавлен, концентрацию образца, полученную по стандартной кривой, необходимо умножить на его коэффициент разбавления.
10.2 Полуколичественное определение
10.1.1 Визуальное полуколичественное определение: сначала выберите подходящий стандартный раствор и проведите его с образцом, и на основе сравнения цвета между образцом и стандартом определите, является ли значение концентрации образца меньше или больше стандартного значения. .
10.1.2 Полуколичественное измерение прибора: сначала выберите подходящий стандартный раствор и проведите его с образцом, и на основе сравнения значений оптической плотности определите, меньше или больше значение концентрации образца, чем стандартное значение. образца и стандарта.
11 специфичность
Вещество Перекрестная реакция фипронил 100%
12 Параметры комплекта
Нижний предел обнаружения этого набора – 0,05ppb. Наилучшее значение абсорбции B0 должно быть больше 1,0.
Погрешность в планшете набора для оптической плотности составляет менее 8%, а ошибка между планшетами – менее 15%. Показатель восстановления при использовании метода извлечения образца ткани, описанного в этом руководстве, превышает 80%. 13
Стандартный диапазон кривой, предоставляемый комплектом, составляет 0,1ppb ~ 8,1ppb.
14 Ограничения анализа
Положительные образцы, полученные с помощью этого набора, должны быть подтверждены другим методом, таким как ВЭЖХ или ГХ / МС.
