Описание
Тип продукта: Несопряженный
Цикл доставки: на месте
Количество: 3000 раз
премьера продукта
Этот набор для определения жизнеспособности клеток CCK-8 содержит WST-8 (2- (2-метокси-4-нитрофенил) -3- (4-нитрофенил) -5- (2,4-дисульфобензол) -2H-тетразол мононатриевая соль) . В присутствии переносчиков электронов WST-8 окисляется и восстанавливается внутриклеточной дегидрогеназой с образованием водорастворимых оранжево-желтых формазановых красителей, которые можно растворить в среде для культивирования тканей. Количество формазана прямо пропорционально количеству живых клеток. Метод CCK-8 – это высокочувствительный нерадиоактивный колориметрический метод обнаружения, используемый для определения количества живых клеток в экспериментах по пролиферации или токсичности клеток, который может заменить традиционный метод МТТ.
Выносите собственные инструменты и реагенты из набора.
Низкоскоростная центрифуга, устройство для считывания микропланшетов (длина волны 450 нм), шейкер для планшетов, микропипетка, 96-луночный культуральный планшет, инкубатор с CO2
Шаги
- Обычно добавляют 100 мкл (2000 клеток) на лунку для экспериментов по пролиферации клеток, добавляют 100 мкл (10000 клеток) на лунку для экспериментов по цитотоксичности (конкретное количество клеток, используемых в каждой лунке, зависит от размера клеток, скорости пролиферации клеток). и т.д.) Факторы определяют). Предварительно инкубируйте культуральный планшет в инкубаторе в течение 24 часов (при 37 ° C, 5% CO2).
- В соответствии с потребностями эксперимента культивируйте и дайте 0-10 мкл специфической лекарственной стимуляции.
- Держите культуральную чашку в инкубаторе в течение соответствующего периода времени (например: 24 или 48 часов).
- Добавьте 10 мкл раствора CCK-8 в каждую лунку. Если начальный объем культуры составляет 200 мкл, необходимо добавить 20 мкл раствора CCK-8, а остальное можно вывести по аналогии. Лунки с соответствующими количествами среды для культивирования клеток и раствора CCK-8, но без клеток, можно использовать в качестве холостого контроля. Если вас беспокоит, что используемые препараты могут помешать проведению теста, вам необходимо установить в лунки соответствующее количество среды для культивирования клеток, лекарств и раствора CCK-8, но не добавлять клетки в качестве холостого контроля. (Старайтесь не создавать пузыри в отверстии)
- Инкубируйте культуральный планшет в инкубаторе в течение 1-4 часов.
- Измерьте оптическую плотность при 450 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов.
- Если вы не хотите временно измерять значение OD и планируете измерить его позже, вы можете добавить 10 мкл 0,1 M раствора HCl или 1% (W / V) SDS-раствора в каждую лунку и накрыть культуральный планшет, чтобы избежать свет и хранить при комнатной температуре. Поглощение не изменится в течение 24 часов.
Результат суждения
(1) Выживаемость клеток: вычтите фоновое значение OD из значения OD каждой тестовой лунки (полная среда плюс CCK-8, без клеток) и возьмите среднее значение ± SD для значения OD каждой повторяющейся лунки.
Уровень выживаемости клеток выражается как T / C%, T – значение OD для клеток с добавленным лекарством, а C – значение OD для контрольных клеток. Уровень выживаемости клеток% = (OD клеток с добавленным лекарством / OD контрольных клеток) × 100
(2) Найдите концентрацию лекарства при T / C = 50% (IC50) или концентрацию лекарства при T / C = 10% (IC90).
Условия хранения: 4 ℃ в защищенном от света месте, срок годности 1 год.
Меры предосторожности
- Обратите внимание на то, что суспензия клеток должна быть перемешана во время инокуляции, чтобы избежать осаждения клеток, в результате чего количество клеток в каждой лунке будет неодинаковым, вы можете перемешивать ее каждый раз при инокуляции нескольких лунок. Питательная среда в круге отверстий вокруг культуральной чашки легко улетучивается. Чтобы уменьшить количество ошибок, рекомендуется добавлять только среду или стерильный PBS в каждое отверстие на четырех сторонах планшета для культивирования, а не в качестве отверстия для определения индекса.
- Лучшее время отклика CCK-8 зависит от лучшего времени для проявления определенного цвета. При первом проведении эксперимента рекомендуется сделать несколько лунок, чтобы узнать оптимальное количество инокулированных клеток и оптимальное время инкубации после добавления реагента CCK-8. В нормальных условиях лейкоцитам труднее развить цвет, поэтому требуется более длительное время реакции CCK-8 или увеличение количества клеток (~ 105 клеток на лунку). Подвесные клетки с трудом приобретают цвет по сравнению с прикрепленными клетками. Что касается суспензионных клеток, после добавления CCK-8 и инкубации в течение 1-4 часов их можно сначала вынуть из инкубатора, а степень окрашивания можно наблюдать визуально или определить с помощью считывающего устройства для микропланшетов, чтобы определить наилучшее время инкубации для CCK. -8. Если трудно развить цвет, поместите культуральный планшет обратно в инкубатор и продолжайте инкубировать в течение нескольких часов перед измерением. Для прикрепленных клеток время инкубации CCK-8 обычно составляет 1-4 часа. Большинство клеток можно визуально наблюдать через 30 минут инкубации, и эффект обнаружения лучше всего, когда они инкубируются в течение примерно 2-4 часов.
- Обнаружение этого набора зависит от реакции, катализируемой дегидрогеназой. Если в системе есть другие восстанавливающие агенты, которые необходимо обнаружить, например, некоторые антиоксиданты будут мешать обнаружению, попробуйте удалить их. Среда, содержащая феноловый красный, не влияет на определение жизнеспособности клеток в этом наборе.
- Как определить, является ли тестируемый раствор сводимым? Добавьте 10 мкл раствора CCK-8 в лунки тестового раствора без клеток, инкубируйте в течение 1-4 часов и измерьте оптическую плотность при 450 нм. Если абсорбция мала, это означает, что в тестируемой системе меньше восстанавливающего агента, и CCK-8 может быть добавлен непосредственно в формальном тесте; если абсорбция относительно велика, это означает, что в тестируемой системе больше восстанавливающих агентов, и тестируемая система формально тестируется. В этом случае необходимо удалить среду, дважды промыть клетки средой, а затем добавить новую среду и 10 мкл CCK-8 для обнаружения.
- Если образец представляет собой суспензию клеток с высокой мутностью, рекомендуется установить 600 нм (или более 600 нм) в качестве эталонной длины волны и вычесть значение O.D из эталонной длины волны.
- При работе надевайте лабораторный халат и одноразовые перчатки.
